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El blog de fergonpacheco

TECNICAS BASICAS MICROBIOLOGICAS

9 Julio 2009 , Escrito por fergonpacheco

Microscopia

            El microscopio es, sin lugar a dudas, el instrumento más importante en la microbiología. Se usa para aumentar el tamaño de la imagen aparente de los objetos, lo cual hace posible ver los detalles estructurales de los microorganismos.

            Sus antecedentes más notables se remotan al siglo XVll cuando Antony Van Leeuwenhoek (Delft, Holanda, 1632-1723), reporta a la “British Royal Society” lo siguiente:

            “En el  año de 1675 descubri creaturas vivientes en agua de lluvia que había permanecido sólo unos días en un recipiente… Esto me invito a observar más atentamente el agua, especialmente los pequeños animáculos que me parecían diez mil veces más pequeños que aquellos que pueden percibirse en el agua a simple vista”. 

Leeuwenhoek observo, entre otras cosas, bacterias y protozoarios en el agua de lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental. Sus descripciones son, hasta el momento, excelentes y fácilmente reconocibles.

            El estudio microscópico de los microorganismos proporcionan datos fundamentales para su identificación, como forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos, y permite establecer características como la pureza, presencia de contaminantes, variedad o edad de una población, entre otras cosas.

En la actualidad existen dos tipos de microscopia, según la forma en que se amplifica la imagen.

Microscopia óptica, en esta la imagen se amplifica sucesivamente por una serie de lentes. Este sistema permite obtener aumentos de 100 a 1,000 diámetros y, en algunos casos, hasta 2,000 según el tipo de luz que se utilice y la forma de iluminar el objeto en estudio o preparación. Pueden ser de campo claro, campo obscuro, de contraste de fases, fluorescencia y de ultravioleta. El de campo claro es el mas utilizado para el estudio microbiológico en general.

La microscopia electrónica, es aquella en la cual la amplificación de la imagen se obtiene mediante un haz de electrones (que sustituye a la luz) y un campo magnético (que hace las veces de los lentes). Produce imágenes con aumentos de doscientos mil a cuatrocientos mil diámetros.

 

Microscopio óptico de campo claro. En la microscopia de campo claro, el campo claro o área observada está brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen mas obscuros en el fondo.

            Un microscopio óptico de fondo claro esta integrado por un sistema óptico que permite iluminar el objeto en estudio y amplificar su imagen y un sistema mecánico que da soporte y movimiento a los componentes ópticos Para comprender como funciona un microscopio óptico es preciso entender la forma en que las lentes desvían y enfocan la luz para formar imágenes, esto explicado de forma concisa, el fundamento del funcionamiento es el siguiente: la luz procedente de la lámpara y del condensador atraviesa la preparación (en el cual se encuentra el objeto en estudio) permitiendo que la primera lente (objetivo) forme una imagen aumentada de lo que hay en ella, antes de ser vista, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente (ocular).

Cuando se mira por un microscopio, la imagen de la muestra aumentada, denominada imagen virtual, parece que se encuentra justo detrás de la platina, a aproximadamente 25cm. El aumento total se calcula multiplicando los aumentos del objetivo y del ocular. Por ejemplo si se utiliza un objetivo de 45x con un ocular de 10x, el aumento total de la muestra será de 450x.

 

 

 

 

Funciones de los componentes fundamentales del microscopio.

Sistema mecánico;

Base, Brazo y cuerpo del tubo. Sirven para mantener en posición a todos los componentes del microscopio. Estos son gruesos y fuertes para disminuir la vibración.

Tubo intercambiable del microscopio. Se encuentra insertado en la parte superior del cuerpo del tubo. Soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo seleccionado para una observación

Platina. En ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio. La platina esta equipada para sujetar la preparación y dos tornillos para desplazarla en sentido vertical y horizontal, lo que facilita la localización del objeto y la recisión de la preparación.

Revólver. Es el disco que soporta a los objetivos, éste se gira para colocar el objetivo requerido bajo el tubo.

Tornillo macrométrico o de enfoque aproximado. Este permite desplazar el tubo del microscopio (o a la platina en algunos modelos) acercando a el objetivo a la preparación, lo que permite localizar la imagen y dar un enfoque aproximado.

Tornillo micrométrico o de enfoque preciso. Con éste se puede desplazar el tubo de forma mas lenta, lo que permite hacer los movimientos finos que se requieren para obtener el enfoque exacto y preciso que se requiere.

Sistema óptico

Esta integrado por una fuente luminosa, una fuente condensadora de luz que la dirige hacia el espécimen y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificación de la imagen.

Interruptor

Fuente de luz. Es una lámpara que se encuentra colocada debajo el objeto, esta emite la luz que pasa por el condensador, para después iluminar la preparación. Para regular la intensidad de la luz algunos microscopios tienen integrado a la lámpara, un diafragma, el que se abre o se cierra; en otros únicamente se regula el voltaje.

Diafragma de campo

Condensador. Esta interpuesto entre la fuente de luz y la muestra. El condensador recibe la luz de la lámpara, rectifica los rayos de luz y los concentra o los enfoca en un cono de luz sobre el campo donde se sitúa la muestra, de tal manera que los rayos, después de atravesar la preparación, penetren a la lente del objetivo con el mejor ángulo posible. Para ello el condensador se baja o se sube hasta alcanzar una posición que origine un foco preciso.

Diafragma iris. Controla el diámetro de circulo de luz que sale del sistema condensador. Al mover la palanca del diafragma iris, es posible controlar la cantidad de luz que entra al condensador y regula el paso de luz a la preparación para dar nitidez a la imagen.  El propósito del diafragma no es controlar la intensidad de luz que llega al objeto, sino asegurar que la que sale del condensador llene exactamente la lente del objetivo y originara brillo, por lo que se producirá la claridad de la  imagen.

Objetivos. Son las lentes que amplifican la imagen del campo microscópico y por tanto del objeto en estudio. La mayoría de los microscopios tienen tres objetivos que proporcionan diferentes aumento, siendo los m’as comunes 10x, 40x y 90 o 100x. La lente de bajo poder de aumento, abarca un campo microscópico con una superficie mayor, esta se utiliza para localizar los objetos de interés y para seleccionar el espécimen a observar. La lente de 40x, permite la visualización detallada de microorganismos grandes como algas, protozoarios y hongos. La lente de 90x o 100x (que se emplea con aceite de inmersión), se utiliza para observar bacterias o microorganismos eucariotas  pequeños. Cuando el microscopio es para focal, las distintas  lentes están ajustadas de tal manera que al enfocar el espécimen con una lente, así permanece al cambiar a otros objetivos. De esta manera, se puede enfocar con el objetivo de poco aumento y cambiar a los objetivos de mayor aumento sin volver a enfocar.

Ocular. Esta lente amplifica más la imagen procedente del objetivo y permite que a esta la perciba el ojo. El ocular se encuentra insertado en el tubo intercambiable.

 

La función de los sistemas de lentes amplificadas interpuestas entre la muestra y el ojo (objetivo y ocular) consiste, en gran parte, en aumentar el ángulo aparente que forman con el ojo los objetos que están dentro del campo microscópico.

Para hacer una buena observación, es muy importante que la imagen aumentada no se encuentre distorsionada, de manera que retenga los detalles esenciales del espécimen. En microscopia óptica, especialmente en la de pequeño aumento, existen varios tipos de distorsiones que resultan de las propiedades de los lentes.

 

Resolución de un microscopio 

            La parte mas importante de un microscopio es el objetivo que debe crear una imagen aumentada, pero además clara. Por ello la resolución es muy importante. La resolución es la capacidad de una lente para separar o distinguir entre objetos pequeños que están muy próximos, determinando la máxima amplificación útil que se puede obtener de un microscopio óptico. La mayor parte de la teoría óptica que fundamenta el diseño de un microscopio fue desarrollada por el físico alemán Ernst Abbé en la década de 1870. La distancia minima (d) requerida para visualizar dos objetos como entidades separadas esta determinada por la ecuación de Abbé, en la que lambda (λ) equivale a la longitud de onda de la luz empleada para iluminar, y n sen θ, la apertura numérica (AN).

Al disminuir d, aumenta la resolución y el detalle con el que se distingue una muestra. La longitud de onda debe ser inferior a la distancia entre dos objetos, de lo contrario no se verán con claridad. En consecuencia, la mayor resolución se obtiene con luz de longitud de onda menor, la que se corresponde con el extremo azul de espectro visible (en la gama de 450 a 500nm).

De acuerdo con la teoría óptica, la resolución mas alta posible en un microscopio de luz compuesto permitirá ver con claridad objetos cuyo diámetro sea de casi 0.2µm. Lo que indica que el poder de resolución es igual al diámetro de la estructura visible más pequeña.

La amplificación  que aumenta el tamaño pero no su detalle se denomina amplificación o aumento vacio.

La apertura numérica de la lente es función del diámetro real del objetivo en relación con su distancia focal (una lente funciona como un conjunto de prismas. Los rayos de luz de una fuente distante se enfocan en un punto focal F. El punto focal queda a una distancia f, del centro de la lente). La luz que incide sobre un microorganismo despues de atravesar un condensador tiene forma conica. Cuando este cono tiene un angulo estrecho, formara un vertice muy agudo que no se extendera mucho mas allá despues de alejarse del portaobjetos, por lo que no se separara adecuadamente las imágenes de objetos muy proximos entre sí. En este caso, la resolucion es baja. Por el contrario si el cono de luz tiene un angulo de luz muy abierto, en este caso si que se proyectara a mas distancia despues de atravesar la muestra, permitiendo asi que incluso los objetos muy proximos aparescan claramente separados y puedan identificarse como independientes. El angulo del cono de luz que puede penetrar una lente depende del indice de refracción (n) del medio en que se encuentra la lente del objetivo. El indice de refrccion del aire es de 1.0. como sen θ no puede ser superior a 1 (el maximo de θ es 90° y el seno de 90° es 1.0), ninguna lente que funcione en el aire pude tener una apertura numerica superior a 1.0. La unica forma de incrementar por encima de 1.0 y conseguir, con ello, una resolucion mayor, es aumentando el indice de refraccion con aceite de imresion, un liquido incoloro con el mismo indice de refraccion que el vidrio. Si se sustituye el aire por aceite de inmersion, muchos rayos de luz que no pueden pasar por el objetivo debido a la reflexion y refraccion en las superficies de su lente, podran hacerlo. Con ello se consigue aumentar la apertura numerica y la resolucion.

La resolucion de un microscopio depende de la apertura numerica del condensador y del objetivo. Esto queda demostrado por la ecuacion que define la resolucion total del microscopio.

 

La mayoría de los microscopios tienen un condensador con una apertura numérica teórica entre 1.2 y 1.4. Sin embargo, la apertura numérica del condensador no será muy superior a 0.9, salvo que se ponga aceite en la parte superior del condensador hasta alcanzar el porta objetos. El poder de resolución máximo teórico de un microscopio con un objetivo de inmersión en aceite (apertura numérica de 1.25) y con luz azul verdosa es de aproximadamente 0.2µm. Es decir, en el mejor de los casos, un microscopio de campo claro puede distinguir como independientes dos puntos separados por aproximadamente 2 µm (tamaño de bacteria muy pequeña)

            Otros factores relacionados con el sistema de la lente utilizada son la profundidad del campo y el área del campo.

 

Coeficiente de aumento del objetivo

10x

40x

90x

Amplificación con ocular 10x

 

Apertura numérica

 

Poder de resolución en µm

 

Profundidad de campo aproximada en µm

 

Área de campo aproximada con ocular 10x, en mm

100x

 

0.25

 

2.0

 

7.0

 

1.5

400x

 

0.76

 

0.45

 

1.3

 

0.35

900x

 

1.30

 

0.27

 

0.5

 

0.17

 

            El sistema de iluminación es de suma importancia, en especial, cuando se emplean objetivos de alto poder de amplificación. La cantidad de luz que entra en el sistema debe enfocarse en el espécimen y para este propósito se usa el sistema de lentes del condensador y el diafragma iris; el primero permite obtener un foco preciso en tanto que el segundo controla el círculo de luz que sale del condensador, ver esquema siguiente:

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