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El blog de fergonpacheco

Tecnicas basicas.....

9 Julio 2009 , Escrito por fergonpacheco

 

Microscopio de fluorescencia

            La flouresencia es la propiedad que tienen algunas sustancias para emitir luz, después de haber sido espuestas a una radiación de longitud de onda corta a la que se denomina radiación exitadora (UV). La luz fluorescente emitida tiene una longitud de onda mas larga que la radiación con la cual se irradia la sustancia fluorescente.  La radiación emitida por la sustancia florescente tiene menor energía que la radiación inicial o de excitación.

Consecuentemente, una sustancia fluorescente puede ser exitada por una radiación invisible como la luz ultravioleta, para ser vista en el espectro visible. O bien puede excitarse con radiación cuya longitud de onda corresponde al azul o verde y la luz que se emite tendrá una longitud de onda mas larga que corresponde a la fluorescencia verde, amarilla o roja. Esta técnica es particularmente útil en la búsqueda de agentes como bacterias y virus que no fluorescen y por tanto, hay que ponerlos en condiciones de emitir radiación fluorescente útil para su observación.

Existen sustancias que contienen fluorescencia propia, a la que se denomina fluorescencia primaria, como por ejemplo la clorofila, vitaminas y aceites de inmersión. 

La fluorescencia de MO o de estructuras biológicas no fluorescentes se consigue con fluorocromos, los que son considerados como colorantes.

Actualmente se conocen una gran cantidad de fluorocrmos y entre los mas usados se encuentran: la Auramina, Rodamina, iosocianato de fluoresceína, acriflavina y naranja de acridina.

Elementos importantes de un microscopio de fluorescencia

Fuente de luz. La luz emitida por la fuente debe tener la suficiente radiación de aquellas longitudes de onda requeridas para la excitación de los fluorocromos. Generalmente se usa una fuente de mercurio a alta presión  (HBO 50). Cuando se requiere excitar con exclusivamente una lámpara de luz azul, se usa la lámpara incandescente potente de halógeno (Hal 100W).

Filtro de excitación. El filtro de excitación debe permitir el paso de la radiación necesaria o bien útil para el método usado y retener todas aquellas longitudes de onda de la emisión de la fuente de luz que no son útiles para la excitación.

Filtro supresor selectivo o filtro barrera. Este retiene la luz de excitación de longitud de onda corta (UV) que no es absorbida por el espécimen y que podría llegar a los ojos del observador y ocasionar daño.

Cuidado y limpieza del microscopio

            Como todo instrumento de precisión, el microscopio debe cuidarse con esmero. Lo principal, desde luego, es manejarlo con precaución, solo debe moverse lo indispensable, sujetándolo firmemente con ambas manos y depositándolo con suavidad.  

 

Todos los componentes del microscopio deben embonar perfectamente y moverse con suavidad y facilidad; nunca debe forzarse la colocación de la pieza ni su movimiento.

Debe evitarse el polvo, ya que tiende a depositarse en las cremalleras y en las lentes, también debe resguardarse de la humedad y calor excesivo, conservar las lentes limpias.

Preparaciones

La forma de prepara especímenes de microorganismos para su estudio microscópico, depende del tipo de microscopio, el propósito especifico del estudio y el tipo de microorganismos. Por ejemplo las preparaciones para microscopia electrónica se tiñen con compuestos de metales pesados como osmio y plomo que son opacos a los electrones. Para la microscopia de fluorescencia se utilizan sustancias que florecen bajo la luz UV. Para la microscopia de campo oscuro y de contraste de fases se utilizan preparaciones en fresco sin teñir.

 Existen dos técnicas de preparaciones

Preparaciones en fresco, también llamadas “humedas” o para “examen directo”, sin teñir, o tenidas con colorantes vitales. Se emplean para observar la movilidad, el tamaño y la forma de agrupación de los microorganismos en su estado natural; asi como gránulos refráctales, esporas sin teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. Permiten observar microorganismos vivos, en su estado natural y sin alteraciones que provocan la fijación y las tinciones. Sin embargo la observación es difícil por que la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y de los microorganismos, no permite un buen contraste; por otra parte, el movimiento contibuo de los microorganismos, asi como, el causado por corriente en el fluido, frecuentemente hacen difícil la observación.

Las preparaciones en fresco se pueden hacer:

En gota pendiente o suspendida, colocando el fluido que contiene a los microorganismos (muestra) en un cubreobjetos e invertiéndolo rápidamente sobre un porta objetos.

 

Preparación húmeda o en portaobjetos normal, simplemente colocando una asada o gota de la muestra en el porta y el cubre. En algunos casos para evitar la desecación del fluido, se sellan los bordes del cubreobjetos con vaselina o aceite. Se puede observar el fenómeno de aerotaxia.

 

En el microscopio de campo claro, las preparaciones humedas se observan mejor disminuyendo la intensidad de la luz. Los microscopios de de campo oscuro y de contraste de fases resuelven el problema de falta de contraste mediante sus sistemas de iluminación.

1.      Preparaciones fijas. Para eliminar los movimientos que dificultan la observación en las preparaciones en fresco, Koch ideo fijar los especímenes, secándolos sobre el porta objetos mediante calentamiento moderado; pero persistía el problema de escaso contraste, asi que intento las técnicas de coloración utilizadas por los histólogos de la época, principalmente Weigart quien había logrado detectar bacterias en preparaciones histológicas, tiñendo con violeta l de metileno.  

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