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El blog de fergonpacheco

Tecnicas basicas..

9 Julio 2009 , Escrito por fergonpacheco

 

Tinciones

El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especímenes delicados se utiliza la fijación química, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos.

Algunos colorantes precipitan y se disuelven en componentes celulares, como el negro de Sudan que es liposoluble y permite distinguir los glóbulos de grasa.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movimiento de los microorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas Poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

La aplicación de diferentes colorantes según sus propiedades y las combinaciones de colorantes, mordentes y decolorantes, han permitido desarrollar tinciones que puedan agruparse en;

Tinciones simples

Tinciones  diferenciales

Tinciones selectivas.

Las Tinciones simples: consisten en aplicar un solo colorante a ala preparación para observar la morfología de los microorganismos. Se usan principalmente colorantes básicos como el azul de metileno, cristal violeta o safranina

Las Tinciones diferenciales: consisten  en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y decolorantes que permitan poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de los microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que aun cuando tengan igual morfología, presenten diferencias en su composición química. Las dos tinciones diferenciales  mas importantes que se aplican a la bacteriología son:

Gram

Ziehl-Neslsen

Las Tinciones selectivas: Son aquellas que permiten observar un organelo celular determinado, pr que el colorante se combina selectivamente con el; en algunos casos, se requieren mordentes, agentes acidificantes o precipitantes para lograr la combinación especifioca colorante-organelo; también suelen usarse colorantes de contraste, para distinguir el resto de la celula. Las tinciones selectivas mas importantes son :

Tinción de endoesporas

Tinción de flagelos

Tinción de núcleo

Tinción de capsula

 


Cultivo de microorganismos

            Por su tamaño minúsculo, los microorganismos no pueen estudiarse como individuos, si no que es necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir favorecer su crecimiento in vitro en ambientes especiales que proporcionan las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales.  Proporcionando los nutrientes necesarios para su crecimiento y multiplicación y eliminando a todos aquellos que interfieren en el estudio del microorganismo de interés.
            Gran parte de los estudios en microbiología dependen de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto es solo posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.

Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como fuente de energía, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos son los nutrientes.

Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn

Medios de cultivo.

            Todas las formas de vida, desde los microorganismos hasta los seres humanos, toman del ambiente las sustancias que requieren para sintetizar su material celular, generar energía y efectuar un buen funcionamiento. Estas sustancias se denominan nutrientes. Los microorganismos son extraordinariamente diversos en cuanto a sus propiedades fisiológicas específicas y por consiguiente, en cuanto a sus requerimientos nutricionales específicos.

            De este modo, en los laboratorios se han diseñado múltiples medios de cultivo (mezclas de agua y sustancias orgánicas y/o inorgánicas) que contienen todos los nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimentos específicos de aquellos microorganismos que se desean propagar y cultivar.

 

Los medios de cultivo pueden variar en su composición, no solo en función del grupo microbiano para el cual se utilizan, si no también por su complejidad química, su estado físico y por su aplicación.

 

Por su estado fisoco los medios de cultivo pueden clasificare en:

 

MEDIOS LÍQUIDOS. Se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua destilada). Una vez disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor.

MEDIOS SÓLIDOS. Hacemos lo mismo que para los medios líquidos, pero, al disolver en agua destilada, añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas petri cuando está a unos 60º. Cuando alcance los 50º, ya será sólido.

MEDIOS SEMISÓLIDOS. Su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar.

 

En función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:

 

Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias orgánicase inorgánicas puras disueltas en agua destilada.

·

Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composiciónindefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril...

 

La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo está consumiendo. Ejemplos:

·

Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua

Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

 

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS ENRIQUECIDOS. Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales... Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos. Ejemplo: agar−sangre.

MEDIOS SELECTIVOS. Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituímos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla.

MEDIOS DIFERENCIALES. Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera determinada.

 

Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa salmón.

 

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Es un medio específico para enterobacterias.

Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que sólo se desarrollen las gram − que puedan tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa.

Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras.

CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN

Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo.

 

Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas:

 

Métodos para determinar crecimiento

La célula bacteriana es esencialmente una maquinaria de síntesis capaz de duplicarse a sí misma. El proceso de síntesis para el crecimiento bacteriano involucra unas 2000 reacciones químicas de una amplia variedad. Una vez sintetizados los polímeros, el crecimiento continúa con el ensamblaje y formación de nuevas estructuras celulares que finalizan con la división en dos células hijas. En un medio apropiado física y nutricionalmente, un cultivo se reproduce continuamente como células vegetativas, los nutrientes absorbidos y metabolizados permiten crecer al microorganismo.

a) Crecimiento. Es definido como un incremento ordenado de todos los constituyentes y estructura celular. En muchos microorganismos, este incremento continúa hasta que la célula se divide en dos nuevas células: Fisión binaria
El crecimiento microbiano conlleva usualmente a un incremento en el número de células. Es importante distinguir entre el crecimiento individual de células y el crecimiento de poblaciones de células:

b) Crecimiento individual. Es el incremento en el tamaño y peso y es usualmente un preludio a la división celular

c)  Crecimiento poblacional. Es el incremento en el número de células como una consecuencia del crecimiento y división celular

d) Tasa de crecimiento. Es el cambio del número de células o masa por unidad de tiempo

e) Generación. Intervalo para la formación de dos células provenientes de una.

f) Tiempo de generación. Tiempo que tarda una población en duplicarse. Se puede definir también como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de división.

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO

Factores externos

Condiciones ambientales o culturales: pH, T°, Aw, O2, CO2
Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1

Factores internos

Capacidad metabólica

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Micro 01/31/2011 14:28


Muy interesante el artículo.
Felicidades, sigue así.
Un saludo.