Tecnicas basicas

Caracterización y mantenimiento de cultivos puros

 El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico. Cuando se ha sembrado una población heterogénea de células , es posible a veces identificar la colonia deseada por su aspecto general y utilizarla para obtener un cultivo puro. La estructura de las colonias bacterianas se ha examinado con el microscopio. En la naturaleza, las bacterias y muchos otros microorganismos crecen con frecuencia formando biofilms. Sin embargo , a veces forman discretas colonias.

  Mantenimiento de cultivos purso

                      ALMACENAMIENTO A TEMPERATURAS BAJAS

                      Ponemos las bacterias con glicerol al 20 − 50% a −70º y podemos mantenerlas así durante años, décadas...

                      LIOFILIZACIÓN

                     Es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilización. La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de sólido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante décadas.

COLECCIONES DE CULTIVO

En todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de cultivos tipo), que está en Valencia. La más grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).

Esterilización

Para poder estudiar el comportamiento  de los MO en el laboratorio, el microbiólogo deberá contar, entre otras cosas con material y medios de cultivo estériles.

La esterilización es el proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida de un objeto, medio o superficie. Esterilizar es un termino absoluto, es decir, que algo esta esteril o no lo esta, pero nunca podrá decirse que esta casi esteril. Para lograr este fin se cuenta con una variedad de métodos y su elección dependerá de la  naturaleza del material que se va a esterilizar.

Métodos de esterilización:

 Esterilización por calor. Las temperaturas elevadas pueden causar diversos danos a la célula, que van desde la inactivación de unas enzimas hasta la desnaturalización de proteínas y, por lo tanto, la muerte del microorganismo. El efecto dependerá de la temperatura y el tiempo de exposición.  Las células en estado vegetativo mueren a los pocos minutos a una temperatura de 65° C, pero las esporas y algunos microorganismos son mas resistentes, por esta razón, si se desea esterilizar un objeto o medio, deberán aplicarse temperaturas mas altas por periodos de tiempo tales que destruyan todo genero de vida. La esterilización por calor puede ser húmedo o seco

Calor húmedo. El calor en forma de vapor saturado a presión, es el agente de esterilización mas usado, ya que cuando el ambiente es húmedo se favorece la penetración del calor en la célula y por consiguiente hay una coagulación de proteínas. Para efectuar este proceso se utiliza un aparato llamado autoclave que consta básicamente de una cámara de doble pared, un termostato, termómetro, manómetro, válvulas para regular la presión, resistencias y llaves de entrada y salida de agua.  El efecto de esterilización se logra a una temperatura de 121°C y una presión de 1.1kg/cm², aplicadas durante 15 0 20 minutos, esto en función de la carga que tenga el aparato, la temperatura y el tiempo esta en función del material a esterilizar. Para verificar que el lote introducido al autoclave se esterilizo, es necesario el uso de bioindicadores, que se ponen junto con el material a esterilizar y después se comprueba la viabilidad de los microorganismos que están en las ampolletas

a)      Calor seco. El calor seco se recomienda siempre que el vapor de agua a presión no sea deseable o posible que entre en contacto directo con el material que se va a esterilizar. Se utiliza para esterilizar cristalería limpia y seca, como pipetas, cajas de petri, aceites, polvos, y algunos instrumentos quirúrgicos. Para que se complete u ciclo de esterilización se necesita exponer por una hora a una temperatura de 180°C. La esterilización por calor seco se fundamenta en que en una atmosfera seca el calor ocasiona la oxidación de los componentes celulares vitales. Para efectuar el manejo correcto de un horno se debentomar en cuenta los siguientes factores. La transferencia del calor a los materiales debe ser buena, el tiempo de precalentamiento, contar el tiempo de esterilización a partir del momento en que el horn alcanzo la temperatura de 180°C, no abrir el horno hasta que el ciclo este completo, que la temperatura haya descendido a +/- 70°C.

La incineración. Es un método de esterilización eficaz, per de aplicación limitada, la llama roja del mechero se emple para esterilizar el asa de siembra, que sirve para transmitir organismos de un lugar a otro.

Esterilización por filtración. Esta se emplea para esterilizar sustancias termolábiles, como sueros, antibióticos, azucares, etc. El material filtrante es de diferente naturaleza y puede ser de asbesto, tierra de diatomeas, porcelana, membranas de ester de celulosa. La eliminación de los microorganismos esta en función de la carga eléctrica y del tamno de los poros del material filtrante.

1.      Flujo laminar. Esta técnica permite controlar la contaminación proveniente del aire, mediante dos procesos simultáneos

El paso de aire a través de filtros absolutos y

La regulación de la velocidad del aire filtrad.

Los filtos absolutos corresponden a HEPAVECOFOLW, los que retienen partículas de 0.3 micras en adelante y cuyo diseño obliga a las partículas detenerse en el medio filtrante.

La eficiencia de este tipo de filtos ha sido evaluada electrónicamente, con resultados de 99.97 a 99.99%. las campanas de flujo laminar van a permitir obtener una zona estéril para aplicaciones tales como: preparación de ciertos medio de culto, siembra de microorganismos no patógenos, preparación de muestras con soluciones intravenosas, llenado de frascos o ampolletas con productos estériles como soluciones parenterales y antibióticos.

Esterilización por radiación. Las radiaciones mas comunes que se usan para destruir a los microorganismos son; la luz infrarroja y los rayos gamma. La luz ultravioleta es absorbida por las proteínas celulares, altera el orden de las bases puricas y pirimidicas; como este tipo de radiaciones entran lentamente deben aplicarse directamente y por periodos considerables. Su uso principal es como agete esterilizador de superficies, como mesas y bancos de trabajo, para los aerosoles suspendidos en el aire de las salas de operación y los gabinetes en donde se tomaron muestras microbiológicas.

Esterilización gaseosa. Algunos gases ejercen una poderosa acción letal sobre los microorganismos, ya que destruyen varias enzimas y estructura vitales para la duplicación de microorganismos. Un ejemplo es el oxido de etileno.   

Efecto de antibióticos y otros agentes quimioterapeuticos

Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los tejidos

Historia

1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de síntesis como "balas mágicas" selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es efectivo contra la sífilis. Acuña el término "quimioterapia".

1932-35 Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo.

1940 Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas. Estamos en plena "Edad de oro de la Quimioterapia de síntesis".

1929 Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacéutica se muestra "indiferente".

1940 Chain y Florey purifican la penicilina.

1944 Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una búsqueda de microorganismos productores de antibióticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos.