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El blog de fergonpacheco

Metodos de aislamiento y replicacion.

9 Julio 2009 , Escrito por fergonpacheco

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).

En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).

Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad

 

METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:

1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanálisis (EIA), Test de Aglutinación.

3.La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).

4.El virus como partícula viral (microscopía electrónica).

1. Aislamiento Viral - Cultivos Celulares

La base del diagnóstico viral es la detección del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la técnica standard de oro sobre la cual se medían todas las otras pruebas de diagnóstico viral, pero hoy en día con el desarrollo de las nuevas técnicas de Biología Molecular ya no es la más sensible. De igual forma el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que sólo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda días a semanas para la identificación, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atención del paciente. Además, es un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias líneas celulares para la detección óptima de virus.

Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos más corrientemente empleados para la propagación de los virus.

Un cultivo celular es obtenido, de explantes de órganos o de embriones de animales.

Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspención de celulas libres así obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican formando una fina capa de células que se llama MONOCAPA CELULAR.

Esta monocapa de células crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminación bacteriana adicionándole al medio antibióticos adecuados.

Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc.).

Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.

Líneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen.

Líneas Celulares Continuas: Permite un número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas:

Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de células idénticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario.

Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios.

Libre de contaminación con agentes extraños.

Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relación específica huésped-virus, y es en función de los datos clínicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material.

Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37º C por un período de hasta 14 días promedio, esperando la aparición de efecto citopático, toxicidad o degeneración celular, observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados. El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos más o menos característicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus sobre el cultivo celular.

METODOS INDIRECTOS

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped: . Detección de anticuerpos específicos antivirales por técnicas inmunológicas (EIA, IFI, WB, etc.).  Producción de anticuerpos in vitro.

En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentración residual y, en cambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero extraída en el período agudo de la enfermedad. Este método se emplea para el diagnóstico de enfermedades como: Rubéola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.

La búsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza como técnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma muestra de suero por otra metodología.

La seroconversión es el aumento del título de anticuerpos cuatro veces o más observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendrá en el período agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 días después de la primera, en el período de convalesencia.

La seroconversión es útil para establecer el diagnóstico retrospectivo, pero no para el diagnóstico temprano de una infección, puesto que debemos esperar al período de convalecencia para obtener la segunda muestra del suero.

Este tipo de diagnóstico es útil para estudios epidemiológicos.

Las diferencias de títulos deben ser mayores de cuatro veces para tener valor estadístico y se debería estudiar ambas muestras simultáneamente.

Las determinaciones serológicas también nos pueden informar sobre el estado inmune del paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas, sarampión y rubéola, donde la presencia de anticuerpos específicos indica que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y que es inmune para una nueva infección.

A veces el diagnóstico serológico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en recién nacidos para identificar la causa de una infección congénita. La evaluación de los resultados en este caso es difícil porque los ensayos serológicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG presente en el suero del niño provino de la madre por vía transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del niño de la IgG de la madre.

Tradicionalmente, el diagnóstico de las enfermedades virales congénitas se realiza mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos y que el niño no está infectado. El aumento en el título de anticuerpos indica que el niño esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta infectado. Sin embargo, hoy en día el diagnóstico serológico viral se ha simplificado con las nuevas técnicas que detectan IgM, ya que la detección de IgM específica en el suero del niño confirma que el niño está infectado, porque la IgM no atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen materno.

A continuación, se describirán los métodos serológicos más comúnmente usados en el diagnóstico viral.

Los métodos tradicionales para el diagnóstico serológico de las infecciones virales incluyen: la neutralización, la inhibición de la hemaglutinación (IHA) y la hemaglutinación indirecta (HAI). La confirmación serológica de una infección aguda por cualquiera de estas técnicas tradicionales esta dada por un aumento de cuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble seriadas.

En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para la detección de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en términos de economía, sensibilidad, especificidad y rapidez.

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